Caractérisation de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase: Expression protéine HMG-CoA réductase humaine

L'HMG-CoA réductase catalyse la conversion de l'HMG-CoA en mévalonate, étape reconnue comme limitante dans la biosynthèse du cholestérol et d'autres intermédiaires de la voie du mévalonate. Le plasmide purifié (pGEXtev/hmgr) contenant le gène de l'HMG-CoA réductase humaine a été validé par analyse de restriction et séquençage. Après vérification, il a été transformé dans des cellules compétentes d'Escherichia coli (BL21 et DH5¿), parmi lesquelles la souche DH5¿ a donné les résultats les plus prometteurs. L'expression protéique a été induite par l'IPTG et optimisée davantage en faisant varier la concentration d'IPTG, de bétaïne et de sorbitol, ainsi qu'en ajoutant divers tampons. L'influence de différentes températures sur l'expression protéique a également été étudiée. Le gène d'intérêt (hmgr) a été sous-cloné dans pET 22b. Le plasmide sous-cloné pET22b/hmgr a été induit dans E. coli BL21 et son expression a été optimisée en utilisant différentes concentrations d'IPTG et en prélevant des échantillons à différentes densités optiques (A600). Le plasmide pGEXtev/hmgr dans DH5¿ exprime une protéine de 54 kDa accompagnée d'un tag de fusion GST. La protéine est composée de 283 acides aminés, a un poids moléculaire de 31,1 kDa et un point isoélectrique théorique de 7,68.

Pagina's: 84, Paperback, Editions Notre Savoir