Sviluppo di un costrutto genico reporter per la localizzazione subcellulare

L'RNA pirofosfidrolasi (RppH) avvia la degradazione dei trascritti rimuovendo il pirofosfato dall'estremità 5' degli mRNA, consentendo così il legame con RNasi E/RNasi J nei batteri. Una putativa RNA pirofosforilasi è presente nelle cellule di C. reinhardtii e diverse evidenze suggeriscono che la proteina sia coinvolta nella degradazione dell'mRNA nel cloroplasto. Al fine di determinare la localizzazione della proteina nelle cellule di Chlamydomonas, l'estremità 5' del gene rppH è stata marcata con una proteina fluorescente verde ottimizzata a livello di codoni e introdotta nelle cellule di Chlamydomonas. La GFP (Zsgreen 1) è stata ottimizzata a livello di codoni utilizzando un database sull'utilizzo dei codoni. Il frame di lettura della GFP sintetica ottimizzata è stato regolato e clonato nel vettore pBluescript-5'rppH SK+. Il frammento genico 5'rppH-GFP è stato quindi clonato in tre vettori. Tutti i costrutti sono stati verificati. I trasformanti sono stati sottoposti a screening per la presenza del gene GFP chimerico mediante PCR. Gli esperimenti di screening ci hanno portato a scegliere un trasformante che potesse essere utilizzato per ulteriori lavori. Inoltre, sebbene la fluorescenza non sia stata verificata, la GFP sintetica ottimizzata è stata espressa in cellule di E. coli (BL21DE3), confermando la funzionalità del costrutto GFP sintetica in vivo.