Caracterização da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase: Expressão proteína HMG-CoA redutase humana

A HMG-CoA redutase catalisa a conversão do HMG-CoA em mevalonato, processo conhecido como a etapa limitante da velocidade na biossíntese do colesterol e de outros intermediários da via do mevalonato. O plasmídeo purificado (pGEXtev/hmgr), contendo o gene da HMG-CoA redutase humana, foi confirmado por análise de restrição e sequenciação. Após verificação, foi transformado em células competentes de Escherichia coli (BL21 e DH5¿), tendo a DH5¿ produzido os resultados mais promissores. A expressão da proteína foi induzida com IPTG e posteriormente otimizada através da variação da concentração de IPTG, betaína, sorbitol e adição de vários tampões. A influência de várias temperaturas na expressão da proteína também foi investigada. O gene de interesse (hmgr) foi subclonado em pET 22b. O plasmídeo subclonado pET22b/hmgr foi induzido em E. coli BL21 e a sua expressão foi otimizada através da utilização de diferentes concentrações de IPTG e da recolha de amostras em diferentes OD (A600). O plasmídeo pGEXtev/hmgr em DH5¿ expressa uma proteína de 54 kDa juntamente com a etiqueta de fusão GST. A proteína é composta por 283 aminoácidos, tem um peso molecular de 31,1 kDa e o ponto isoelétrico teórico é 7,68.