Caratterizzazione della 3-idrossi-3-metilglutaril-coenzima A reduttasi: Espressione proteina HMG-CoA reduttasi umana

L'HMG-CoA reduttasi catalizza la conversione dell'HMG-CoA in mevalonato, nota come fase limitante della velocità nella biosintesi del colesterolo e di altri intermedi della via del mevalonato. Il plasmide purificato (pGEXtev/hmgr) contenente il gene della HMG-CoA reduttasi umana è stato confermato mediante analisi di restrizione e sequenziamento. Dopo la verifica, è stato trasformato in cellule competenti di Escherichia coli (BL21 e DH5¿), per le quali la DH5¿ ha prodotto i risultati più promettenti. L'espressione proteica è stata indotta con IPTG e ulteriormente ottimizzata variando la concentrazione di IPTG, betaina, sorbitolo e aggiungendo vari tamponi. È stata inoltre studiata l'influenza di diverse temperature sull'espressione proteica. Il gene di interesse (hmgr) è stato subclonato nel vettore pET 22b. Il plasmide subclonato pET22b/hmgr è stato indotto in E. coli BL21 e la sua espressione è stata ottimizzata utilizzando diverse concentrazioni di IPTG e prelevando campioni a diversi valori di OD (A600). Il plasmide pGEXtev/hmgr in DH5¿ esprime una proteina da 54 kDa insieme al tag di fusione GST. La proteina è costituita da 283 aminoacidi, ha un peso molecolare di 31,1 kDa e un punto isoelettrico teorico di 7,68.