Opracowanie konstrukcji genu reporterowego do lokalizacji subkomórkowej

Pirofosfohydrolaza RNA (RppH) inicjuje degradacj¿ transkryptów poprzez usuwanie pirofosforanu z 5'-ko¿ca mRNA, co umo¿liwia wi¿zanie si¿ RNazy E/RNazy J w bakteriach. W komórkach C. reinhardtii wyst¿puje domniemana pirofosforylaza RNA, a kilka dowodów sugeruje, ¿e biäko to bierze udziä w degradacji mRNA w chloroplastach. W celu okre¿lenia lokalizacji biäka w komórkach Chlamydomonas, koniec 5' genu rppH zostä oznaczony za pomoc¿ zoptymalizowanego pod k¿tem kodonów biäka zielonej fluorescencji (GFP) i wprowadzony do komórek Chlamydomonas. GFP (Zsgreen 1) zostäo zoptymalizowane pod k¿tem kodonów przy u¿yciu bazy danych wykorzystania kodonów. Ramka odczytu zoptymalizowanego syntetycznego GFP zostäa dostosowana i sklonowana do wektora pBluescript-5'rppH SK+. Fragment genu 5'rppH-GFP zostä nast¿pnie sklonowany do trzech wektorów. Wszystkie konstrukty zostäy zweryfikowane. Transformanty zostäy przebadane pod k¿tem obecno¿ci chimerycznego genu GFP za pomoc¿ PCR. Eksperymenty przesiewowe doprowadzi¿y nas do wyboru jednego transformanta, który móg¿by zostä wykorzystany do dalszych prac. Ponadto, chociä nie sprawdzono fluorescencji, zoptymalizowane syntetyczne GFP uleg¿o ekspresji w komórkach E. coli (BL21DE3), potwierdzaj¿c funkcjonalno¿¿ syntetycznego konstruktu GFP in vivo.