Charakterystyka reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A: Ekspresja ludzkiego bia¿ka HMG-CoA

Reduktaza HMG-CoA katalizuje przemian¿ HMG-CoA w mewalonian, co uznaje si¿ za etap ograniczaj¿cy szybko¿¿ biosyntezy cholesterolu i innych zwi¿zków po¿rednich szlaku mewalonianowego. Oczyszczony plazmid (pGEXtev/hmgr) zawieraj¿cy gen ludzkiej reduktazy HMG-CoA zostä zweryfikowany za pomoc¿ analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania. Po weryfikacji zostä on transformowany do komórek kompetentnych Escherichia coli (BL21 i DH5¿), przy czym DH5¿ däa najbardziej obiecuj¿ce wyniki. Ekspresj¿ biäka indukowano za pomoc¿ IPTG, a nast¿pnie optymalizowano poprzez zmian¿ st¿¿enia IPTG, betainy, sorbitolu oraz dodanie ró¿nych buforów. Zbadano równie¿ wp¿yw ró¿nych temperatur na ekspresj¿ biäka. Gen b¿d¿cy przedmiotem zainteresowania (hmgr) zostä subklonowany do wektora pET 22b. Subklonowany plazmid pET22b/hmgr zostä indukowany w E. coli BL21, a jego ekspresja zostäa zoptymalizowana poprzez zastosowanie ró¿nych st¿¿e¿ IPTG i pobieranie próbek przy ró¿nych warto¿ciach OD (A600). Plazmid pGEXtev/hmgr w DH5¿ wyräa biäko o masie 54 kDa wraz z tagiem fuzyjnym GST. Biäko sk¿ada si¿ z 283 aminokwasów, ma mas¿ cz¿steczkow¿ 31,1 kDa, a jego teoretyczny punkt izoelektryczny wynosi 7,68.